Page 108 - 《水产学报》2025年第12期

程佩琳，等 水产学报, 2025, 49(12): 129309

GCTCCTTTTCCCCT-5′)。PCR 扩增在含有 1 μL 表型，条带存在) [26-28] 。
(20 ng/μL) DNA、4 μL (5 pmol/μL) 引物和 15 μL 使用 COLONY 2.0 软件 [38] 进行亲子鉴定分
2× Taq PCR MasterMix (Gene Tech，美国) 的 30 析，将 240 个 F 个体分配给未知的候选父母
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μL 反应体积中进行。PCR 扩增条件： 95˚C 预 (即包含 20 个个体的 F 种群)。该软件同时考虑
1
变性 5 min； 95˚C 变性 30 s，55˚C 退火 30 s， 了整个谱系结构的可能性，可共同推断亲子关
72˚C 延 伸 1 min (35 个 循 环 )； 72˚C 再 延 伸 5 系和兄弟姐妹关系。输入数据包括候选父本
min。使用 ABI 3730XL 测序仪 (Applied Biosys- (CFS)、候选母本 (CMS) 和后代 (OFS) 的基因型。
tem，美国) 进行测序反应。 COLONY 软件使用默认参数运行，设置为中等
采用 24 对长江鲟特异性微卫星引物对亲 运行和完全可能性分析，并假设近亲繁殖存在。
鲟及其后代的 DNA 进行扩增 [25-28] ，引物 5′端使
用荧光修饰 (FAM、TAMRA 或 HEX) (Invitrogen， 2 结果
美国)，将 PCR 产物送至武汉天一辉远生物科
技有限公司进行荧光简单重复序列分型 (SSR 分 2.1 长江鲟亲本及其后代的亲子鉴定分析
型 ) 检 测 。 PCR 扩 增 在 含 有 1 μL (20 ng/μL) 去除侧翼 tRNA 基因的部分序列后，分析
DNA，1 μL (10 pmol/μL) 引物和 5 μL 2× Taq PCR 了 727 bp 的线粒体控制区 D-loop 基因全长序列。
Master Mix 的 10 μL 反应体积中进行。PCR 扩 结果显示，20 尾亲鲟中识别出 2 种单倍型，共
增条件：95˚C 预变性 5 min；95˚C 变性 30 s， 检测到 9 个核苷酸变异位点。240 尾子代中识
62~52℃ 梯度退火 30s，72℃ 延伸 30 s (10 个循 别出 2 种单倍型，共检测到 9 个核苷酸变异位
环，每个循环降 1˚C)；95℃ 变性 30 s，52℃ 退 点 (表 1)。单倍型分析表明亲鲟的单倍型在子代
火 30 s，72℃ 延伸 30 s (25 个循环)；72℃ 延伸 中均有出现。Ⅰ型单倍型亲鲟有 10 尾，雌、雄
20 min。使用 ABI 3730XL 测序仪进行荧光毛细 各 5 尾，Ⅱ型单倍型亲鲟有 10 尾，同样雌、雄
管电泳分离 PCR 产物，获得基因分型数据。 各 5 尾，该结果表明亲鲟群体的线粒体遗传信

1.3 线粒体基因数据分析 息的雌雄性比合适。
采用 24 个微卫星标记对长江鲟亲本及子
测序序列使用 MEGA 11 软件 [29] 中的 Clustal
W 对参考序列进行全局比对，并进行手动校对。 代进行亲子鉴定分析。结果显示，240 尾子代
使用 MEGA 软件分析序列的整体碱基组成。将 来自 30 个不同的父母本组合 (图 1)。其中有 37
比对后的 FASTA 文件导入 DnaSP 6 软件 ，生 个子代来自 1 个父母本组合 (3 861♀×3 621♂)，
[30]
成单倍型数据，导入 PopArt 软件 [31] 分析其频率 另有 6 个父母本组合分别贡献了 22、21、16、
分布。在 DnaSP 6 软件中计算单倍型数量、单 15、14 和 11 个后代。剩余子代个体被分配到
倍型多样性 (H)、核苷酸多样性 (π) 等遗传多样 其他 23 个父母本组合中，每个组合包含 1～9
性信息。 个个体 (图 1，表 2)。最后仍有 17 个后代未能
成功分配到其父本和母本，总分配成功率为
1.4 微卫星数据分析
92.92%。
使用 GeneMarker R 软件 [32] 检测等位基因
2.2 亲本及子代的遗传多样性分析
数、峰图和基因型，并手动排除形成重叠峰错
误。使用 AUTOTET 软件 [33] 计算总等位基因数 基于线粒体 D-loop 全长序列，20 尾亲鱼
(N )、观测杂合度 (H ) 和期望杂合度 (H )，以 的 H 和 π 分 别 为 0.526 ± 0.036 和 0.006 52 ±
e
o
a
及近交系数 (FIS)。使用 PICcalc 软件 [34] 估计多 0.000 45。240 尾子代的 H 和 π 分别为 0.459 ±
态性信息含量 (PIC)。长江鲟是多倍体鱼类，基 0.018 和 0.005 69 ± 0.000 23。
因型数据分型采取了通用的条带共享法 [35-36] ， 基于 24 个微卫星标记，20 尾亲鱼中共检
将多倍体数据转化为二倍体数据。每个微卫星 测到 174 个等位基因，每个标记的等位基因数
[37]
条带被作为个体显性位点进行评分 ，基因型 目为 3～12，平均为 7。每个位点的 H 和 o H 分
e
的值定义为 1 (隐性表型，条带缺失) 或 2 (显性 别为 0.192~1.000 和 0.185~0.884，PIC 为 0.176~
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