Page 106 - 《水产学报》2025年第6期

张玉凤，等 水产学报, 2025, 49(6): 069309

N 106° 108° 110° E

N
大 宁
河 S2
小 !
Daning River
江 S4 奉节县 # ! S1
31° ! #Fengjie County 巫山县
Xiaojiang River
云阳县 # ! S3
Yunyang County ! S5 Wushan County
# 万州区 磨
Wanzhou district Modaoxi River 刀
Yangtze River 溪
S6
忠县 !
#
Zhong County
江 图例
长
30° 御 ! 采样断面
嘉 S12 Yulin River 临 # 长寿区 S8 ! # 丰都县 Fengdu County sampling sections
陵 ! 河 Changshou district S7 龙 ! 河 # 区县
涪陵区
江 江北区 ! S10 # Fulin district Long River district and county
# ! 乌
Jialing River
Jiangbei district 干流
S11 Wujiang River 江
! S9 main stream
# 江津区 支流
Jiangjin district
tributary
! 綦
S13 江
S14 !
29° Qijiang River
0 35 70 km

图 1 长江流域重庆段鱼类 eDNA 采样断面分布图
S1. 巫山断面，S2. 大宁河断面，S3. 云阳断面，S4. 小江断面，S5. 磨刀溪断面，S6. 忠县断面，S7. 龙河断面，S8. 涪陵断面，S9. 乌江断面，
S10. 御临河断面，S11. 南岸断面，S12. 嘉陵江断面，S13. 綦江断面，S14. 江津断面；下同。
Fig. 1 Distribution map of eDNA sampling sections for fish in the Chongqing section of the Yangtze River Basin
S1. Wushan section, S2. Daninghe section, S3. Yunyang section, S4. Xiaojiang section, S5. Modaoxi section, S6. Zhongxian section, S7. Long river sec-
tion, S8. Fuling section, S9. Wujiang section, S10. Yulin river section, S11. Nan'an section, S12. Jialin river section, S13. Qijiang section, S14. Jiangjin
section; the same below.
照 DNA 提取试剂盒 PowerWater DNA Isolation 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳检测合格后通过
Kits 说明书步骤提取滤膜中水样总 DNA，并用 Illumina NovaSeq 6000 测序平台进行高通量测序。

1% 琼脂糖凝胶电泳检测，最后将提取的 DNA 1.3 生物信息学分析
[32]
样品置于−80 °C 超低温冰箱保存备用 。
首先对所有样本的高通量测序结果进行质
线粒体 12S rRNA 位点具高保守性与可变
控和过滤，并将得到的高质量序列片段根据重
性，是鱼类多样性检测效率较高的常用引物区
叠关系进行拼接。其次按照 barcode 和引物序列
域 [33-34] 。本研究使用 12S rRNA 通用引物 (Tele02-
[35]
拆分得到每个样本的优质序列，同时根据正反
F: 5 ′ -AAACTCGTGCCAGCCACC-3 ′; Tele02-R:
barcode 和引物方向对序列方向进行校正。最后
5 ′ -GGGTATCTAATCCCAGTTTG-3 ′ ) 进 行 PCR
用 Usearch 软件和 gold 数据库，采用 de novo
扩增。反应体系为 20 µL，包含 5×FastPfu Buf-
和 reference 结合的方式去除嵌合体。
fer 4 µL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 µL，bar-PCR 上 进行操作分类单元
按照序列相似度≥99%
游引物 0.8 µL，下游引物 0.8 µL，FastPfu 聚合 (OTU) 聚类，将 OTU 代表序列与 MitoFish 数据
酶 0.4 µL，模板 DNA 10 ng，然后加入 ddH O 库 (http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/) 及 NCBI 数
2
补至 20 µL。PCR 反应程序：95 °C 预变性 5 min， 据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 进行比对和
95 °C 变性 30 s，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 分类注释以获取 OTU 相对丰度表。分析过程中，
45 s，变性退火延伸为 30 个循环，72 °C 终延 每个采样断面的 3 个平行样品中，未匹配到鱼
伸 10 min。扩增过程同步设置以 ddH O 2 为模板 类物种的序列被剔除，匹配到的序列取 3 个平
的 PCR 作为阴性对照以评估是否有污染。PCR 行样品结果的均值。OTU 注释分析时筛选标准

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