Page 21 - 《水产学报》2023年第1期

陈松林，等 水产学报, 2023, 47(1): 019102

和 bmp6b)，需要将 bmp6a 和 bmp6b 同时敲除方可 行基因型和肌间刺表型筛选，筛选出双基因突变
获得无肌间刺个体。为加快无肌间刺品系培育，此 的无肌间刺个体自然交配，繁殖 F 无肌间刺群体。
3
研究设计了两轮基因敲除和群体繁育策略 (图 5-a)： 在此研究中，针对 bmp6a 和 bmp6b，在 1 号外显
首先采用 bmp6a 和 bmp6b 进行第 1 轮多位点显微 子各设计 3 个靶位点，对这 6 个 sgRNA 和 Cas9
注射，构建 F 群体；筛选出 bmp6a 或 bmp6b体细 蛋白进行混合注射，经两轮显微注射，在体细胞
0
胞突变率 95% 以上的亲本自然交配，对其受精卵 突变率不少于 95% 的 F 中筛选到 35 尾无肌间刺
1
进行 bmp6a 和 bmp6b 第 2 轮多位点显微注射，构 个体 (图 5-b)，占比 12.96%，并筛选到肌间刺数
建 F 群体；在 F 中筛选双基因体细胞突变率大 量减少 50% 以上的突变体 110 尾，占比 40.74%。
1
1
于 95% 个体，采用 X 射线活体扫描，筛选出无肌 利用 35 尾 F 无肌间刺个体自然交配，繁殖 F 群
1
2
间刺突变体自然交配构建 F 群体；对 F 群体进 体，在 1 500 尾样本中获得 285 尾无肌间刺个体，
2
2
(a) P (c) 野生型
wild type
Cas9+{ bmp6a sgRNA
bmp6b sgRNA
F 0
体细胞突变率不小于 95%
somatic mutation rate≥95% 10 mm
Cas9+{ bmp6a sgRNA 少刺
bmp6b sgRNA
a few IMBs
F 1
体细胞突变率不小于 95%
somatic mutation rate≥95%
X 射线扫描 10 mm
X-ray scan
无刺
no IMBs
无肌间刺亲本
individuals without IMBs

F 2 X 射线扫描
X-ray scan
10 mm
(d) 野生型 F 3 无刺鲫
无肌间刺个体
individuals without IMBs wild type F 3 without IMBs

F 3
无肌间刺个体
individuals without IMBs
(b) 野生型鲫 无肌间刺鲫
wild type no IMBs

5/5 41/41

图 5 无肌间刺鲫种质创制
(a) 无肌间刺鲫种质创制技术路线；(b) F 1 无肌间刺突变体骨骼 micro-CT 照片；(c) F 2 群体 X 射线活体扫描，标尺为 10 mm；(d) F 3 群体骨
骼染色，图中数字分母表示样本数，分子表示表现出肌间刺表型的样本数，标尺为 2 000 μm
Fig. 5 Generation of crucian carp germplasm without intermuscular bones
(a) The technical route for generating the crucian carp germplasm without intermuscular bones; (b) Skeletal micro-CT photos of the F 1 generation
mutants without intermuscular bones; (c) X-ray images of the F 2 generation, the scale bar is 10 mm; (d) Skeletal staining of the F 3 generation, the denom-
inator in the figure represents the number of samples, the numerator represents the number of samples showing the phenotype of intermuscular bones,
and the scale bar is 2 000 μm
https://www.china-fishery.cn 中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries
8