Page 19 - 《水产学报》2023年第1期

陈松林，等 水产学报, 2023, 47(1): 019102

野生型 银白色 灰色
wild type silver-white grey

hps4 -/- csf1ra -/- type I
橘红白 金色 灰黑
orange-white golden grey-black

-/-
tyrb -/- pmela ; pmelb -/- csf1ra -/- type II
mstnb +/+ mstnb -/-

图 2 基因组编辑技术创制的彩色和速生罗非鱼 (图片引自文献 [48-52])
Fig. 2 Colored and fast-growing tilapia created by genome editing technology (Figures cited from references [48-52])
基因组编辑技术将 dmrt1 基因突变后，发现遗传 数目的碱基突变，其中含有缺失 3 的倍数 (不移
雄鱼性腺发育成卵巢样结构，具有卵巢腔，雄性 码) 和非 3 的倍数 (移码) 的碱基，根据转录翻译
性腺发育受阻，精子难以形成，进一步证明了 原理，会产生变异蛋白，从而影响其功能 。
[37]
dmrt1 基因是半滑舌鳎的雄性决定基因，同时，发 海水鱼类在鱼苗阶段养殖成活率低，这对于
现 dmrt1 基因纯合突变的遗传雄鱼生长变快，1 龄 基因组编辑鱼苗的培育非常不利，因此，建立基
时的大小是普通雄鱼的 2 倍，接近正常雌鱼，由 因组编辑鱼苗的精准培育技术至关重要。近几年，
此表明 dmrt1 基因也调控着半滑舌鳎的生长 [33] 。 黄海水产研究所科技人员优化了半滑舌鳎鱼苗培
所用的基因组编辑方法简介 进行半滑 育方法，建立了受精卵孵化、鱼苗培育的标准化
舌鳎雄性决定基因 dmrt1 编辑主要采用 TALEN 方 技术 (图 3)，将基因组编辑的少量鱼苗培育长大并
法。根据 dmrt1 的基因组序列，在外显子 1 起始 达到性成熟，尽管从显微注射胚胎到成鱼的成活
密码子 ATG 下游 80~140 个核苷酸的区段设计一 率大约只有 1/5 000，但仍然获得了一些 dmrt1 基
对 TALEN 结合位点。 按照常规方法，利用 Addgene 因编辑后长大的成鱼。
公司的试剂盒 TALEN Golden Gate toolkit 构建了
基因组编辑鱼的表型测定 Dmrt1 基因编
TALEN 质粒。采用此种方法构建的 TALEN 质粒 辑半滑舌鳎的表型性状主要包括性腺形态结构和
经验证有 90% 的克隆序列正确。这样设计构建的 生长参数。为观察基因组编辑舌鳎的性腺发育情
TALEN 质粒具有高的突变效率。通过显微注射 况，我们采集基因组编辑鱼和对照鱼的性腺组织，
将 TALEN 质粒 mRNA 注射到半滑舌鳎 1~2 细胞 用 Bouin 氏固定液固定 4~16 h，然后保存在 70%
期的受精卵中 [33, 37] 。 酒精里。固定后的组织经过修整、常规洗涤、脱
基因突变鱼的检测与基因组编辑鱼的繁育 水、透明、浸蜡、包埋和切片等步骤制成石蜡切
dmrt1 的突变检测主要通过 PCR 扩增目标基 片。石蜡切片进行苏木素和伊红染色 (H.E 染色)
因片段和序列分析方法进行，检测基因片段的缺 后可在显微镜下观察基因敲除鱼的性腺结构或其
失判断是否发生突变。Cui 等 [33] 对 17 尾转移了 它相关组织的结构。通过半滑舌鳎 dmrt1 基因定
0
dmrt1 TALEN mRNA 的 半 滑 舌 鳎 F 鱼 苗 进 行 点突变鱼苗的性腺组织切片可知，当遗传雄鱼的
PCR 扩增和测序检测，观察到其中 10 尾发生了基 2 个 dmrt1 基因都被突变后雄鱼精巢发育不正常，
因定点突变，突变效率为 58.82%。由测序可知， 横切面呈现卵巢的圆形；精巢结构发育不全，不
dmrt1 TALEN 成功突变了 dmrt1 基因，突变位点 能正常进行减数分裂，形成不了正常精子；中间
在距离起始密码子下游 100~120 bp处，存在不同 有一个正常精巢没有而正常卵巢才有的空腔，退

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