Page 18 - 《水产学报》2023年第1期
P. 18

陈松林，等                                                                 水产学报, 2023, 47(1): 019102

              增含有靶点的       DNA  片段，然后进行酶切，如靶点                  又危害环境。通过分子标记辅助选育和基因组编
              处  DNA  发生突变，则酶切位点可能被破坏，不能                       辑等手段获得单性鱼苗是水产养殖的首选。目前，
              被限制性内切酶切割成           2  条  DNA  条带，仍保留一          在罗非鱼通过       TALEN  和  CRISPR/Cas9  基因组编
              条 完 整   DNA  片 段 ， 如 未 发 生 突 变 ， 则 扩 增 的         辑技术突变了多个性别决定通路关键基因，实现

              DNA  片段被全部切割成          2  条  DNA  条带。T7EI 酶      了由雌向雄或由雄向雌的性逆转。例如突变                    foxl2、
              切法基于突变的靶点           DNA  可与野生型     DNA  片段       cyp19a1a、cyp17a1  导致  XX  罗非鱼性腺发育为精
              退火时产生非完全配对的            DNA  片段被非配对内切             巢；突变     amhy、dmrt1、gsdf、amhr2导致      XY  罗
              酶  T7EI 酶切割的原理识别阳性突变体；反之，若                       非鱼性腺发育为卵巢         [22, 44-47] 。因此，通过基因组编
              靶点未发生突变，则产生完全配对的                  DNA  片段，       辑可以实现养殖鱼类的性别控制。
              无法被    T7EI 切割。PAGE     法是基于突变和野生型                   体色是鱼类重要的经济性状之一。传统上，
              DNA  形成的异源杂合双链           DNA  存在碱基不配对            锦鲤、金鱼等观赏鱼都是通过数百年甚至上千年
              区，可形成环形不配对部分，在非变性凝胶电泳                            的人工选育得到的，而基因组编辑为快速获得体
              条件下，会产生与相应的同源双链                DNA  不同的迁         色突变体提供了可能。采用              CRISPR  技术突变了
              移率。                                              罗非鱼数十个体色形成关键基因，发现纯合突变
                   首先，尽量在靶基因靠前的外显子上选择合                         黑色素前体蛋白关键编码基因              pmela 和  pmelb，创
              适的靶点，设计用于          gRNA  的引物用于模板扩增，              制出了金色罗非鱼 ；纯合突变黑色素合成关键
                                                                                [48]
              体外合成并纯化         RNA。采用显微注射方法在             XY     基因  hps4，创制出银白色罗非鱼 ；突变黄色素
                                                                                            [49]
              罗非鱼受精卵 (1~2       细胞期) 注射基因组编辑组分                 细胞分化的关键基因          csf1ra，创制出灰色和灰体
              gRNA  和  Cas9 mRNA，在注射后       72 h  收集部分胚        黑尾罗非鱼 ；通过突变黑色素合成酶关键基因
                                                                         [50]
              胎用于基因组        DNA  提取，然后扩增含有靶点的                  tyrb  导致完全白化的表型，在红罗非鱼中突变                tyrb
              DNA  片段，利用限制性内切酶酶切法/T7EI 酶切                      导致黑色素细胞缺失但并不影响红色素细胞的存
              法/PAGE   法检测靶点是否工作。待其性成熟时，                       在，结合性别连锁的分子标记辅助技术获得                     tyrb
              通过挤压腹部获取精液，提取基因组                  DNA，通过         缺失的   YY  超雄红罗非鱼，与         XX  红罗非鱼繁殖，
              限 制 性 内 切 酶 酶 切 法 /T7EI 酶 切 法 /PAGE     法 和                                            [51]
                                                               建立了遗传全雄无黑斑红罗非鱼的生产技术 。
              DNA  测序分析精子中含有的突变类型。如果精子
                                                                3.2    半滑舌鳎基因组编辑育种研究进展
              中含有移码突变的类型，则将               F 的 0  XY  阳性鱼与
              XX  野生型雌鱼繁殖获得          F 个体，筛选出靶点处                   半滑舌鳎是我国特有的重要海水养殖鱼类，
                                      1
              移码突变的      F 杂合子。最后将         F 杂合子进行姊            是一种名贵比目鱼类，也是入选国家海水鱼产业
                                            1
                           1
              妹交获得     F 纯合子 。                                 技术体系的      9  大品种之一。不过，半滑舌鳎雌、
                               [43]
                        2
                   生长是一种重要的经济性状。肌肉生长抑制                         雄鱼生长差异巨大，雌鱼比雄鱼生长快                    2~4  倍，
              素  mstn  是骨骼肌生长的负调节因子。利用              CRISPR     2  龄的雌鱼可长到       1 kg，而雄鱼不到      0.25 kg，雄
              基因组编辑技术获得了罗非鱼               mstnb  纯合突变体。        鱼个体小、生长慢的问题严重影响了渔民养殖积
              与野生型相比，5        月龄   mstnb  突变鱼具有明显的双            极性，限制了其养殖产业的发展。我们过去                    10 多
              肌表型。实验室养殖条件下              5  月龄突变鱼的平均            年的研究表明，采用传统的染色体操作、雌核发
              体 重 、 体 高 、 体 宽 分 别 是 野 生 型 的       149.45%、     育、家系选育等技术难以解决半滑舌鳎雄鱼生长
              132.74%  以及  137.21%。突变鱼增重率、肥满度以                 慢、个体小的问题，因此，基因组编辑技术成为
              及特定生长率分别是野生型的                 1.99、1.77  以及      破解半滑舌鳎雄鱼长不大难题的必然选择。
                    [52]
              1.23  倍 (图  2)。                                     靶标基因的克隆与功能分析  中国水产
                 基因组编辑鱼的性状改良  许多养殖鱼类                           科学研究院黄海水产研究所在国内率先建立了海
              呈现生长的性别二态性现象，单性养殖具有更好                            水养殖鱼类基因组编辑技术。首先，我们完成了
              的经济价值。因此，性控育种是水产动物遗传育                            半滑舌鳎全基因组测序和精细图谱绘制，发现
              种领域研究的重点。迄今为止，采用激素诱导产                            dmrt1  基因是半滑舌鳎      Z  染色体连锁、雄性性腺
              生性反转个体是水产养殖业构建单性群体最普遍                            特异表达、精巢发育必不可少的基因，是雄性决
              使用的方法，但是这既不利于消费者身体健康，                            定候选基因     [10] ；为研究  dmrt1  基因的功能，采用

              中国水产学会主办  sponsored by China Society of Fisheries                          https://www.china-fishery.cn
                                                            5
   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23