Page 155 - 《水产学报》2023年第1期

李谣，等 水产学报, 2023, 47(1): 019611

和 Hippel-Lindau 肿瘤抑制因子 (Vhl)；凋亡相关基 算基因的相对表达量。
因：BCL2-Associated x 的蛋白质 (Bax)、半胱氨酸 1.5 脑组织酶活性检测
蛋白酶-3(Caspase-3)、B 淋巴细胞瘤-2(Bcl-2) 和肿
称取 0.1 g 脑组织，用 0.9% 生理盐水冲洗后，
瘤抑制基因 53(p53)；食欲相关基因：神经肽 Y
放入置于冰盒内的 1.5 mL 离心管中，按照重量
(NPY)、肽 YY(PYY)、胆囊收缩素 (CCK) 和人核连
(g)∶体积 (mL) = 1∶9 的比例加入 0.9 mL 的生理
蛋白 2(NUCB2) 的 mRNA 在脑组织中的表达情况。
盐水，冰水浴条件下进行机械匀浆，将匀浆好的
qRT-PCR 反应体系为正、反向引物各 0.45 μL，
10% 匀浆用低温离心机 3 000 r/min 离心 10 min，
Mix 10 μL，ddH O 7.1 μL，模板 cDNA 2 μL，总
2 取其上清制成 10% 的组织匀浆液，分装保存于
体积为 20 μL。反应条件为 95 °C 5 min，1 个循环； −20 °C 冰箱。脑组织蛋白浓度 (TP)、谷胱甘肽过
95 °C 10 s，60 °C 30 s，40 个循环。使用 2 −ΔΔC t 计 氧化物酶 (GSH-Px)、过氧化氢酶 (CAT)、超氧化
物歧化酶 (SOD)、己糖激酶 (HK)、丙酮酸激酶
表 1 引物列表
(PK)、乳酸脱氢酶 (LDH)、琥珀酸脱氢酶 (SDH)
Tab. 1 Description of the primers used in this study
和苹果酸脱氢酶 (MDH) 的活性，丙二醛 (MDA)
基因 引物 引物序列 长度/bp
gene primer primer sequence (5′-3′) length 和脂质过氧化物 (LPO) 的含量采用南京建成生物
HIF-1α-F CTGGAAAGAGGGCTAAGGTG 20 工程研究所提供的试剂盒测定。
HIF-1α
HIF-1α-R AGTGACGGTCCTGAATAGGG 20
1.6 脑组织 H.E 染色切片
HIF-2α-F AAAAGCCCAGTGGATGAC 18
HIF-2α 用 多聚甲醛对脑组织进行固定，以防止
HIF-2α-R TGGCGATGTTGCTGAAGT 18 4%
细胞死亡后自融或分解，操作步骤如下：石蜡切
PHD1-F AGCAATGGTGGCTTGTTAC 19
PHD1 染色，脱水中
PHD1-R TCAAATAAGGGCTCAATGTC 20 片包埋经过脱水，再经脱蜡、H.E
性树胶封片，光学显微镜下观察显微结构，图像
PHD2-F AGCCTGGATGTGAGAAGATAGC 22
PHD2 采集分析。呈蓝色的为细胞核，呈红色的为细胞质。
PHD2-R CCGTCTCCGTTAGGGTTGT 19
PHD3-F CTGTTTGATCGACTCCTGCTT 21 1.7 脑组织 TUNEL 切片检测
PHD3
PHD3-R TGTGGTGCTGCTTTGTGAA 19
将保存在 4% 多聚甲醛溶液中的脑组织进行
Vhl-F AGACGGATGACCCGATGTTG 20
Vhl 常规石蜡包埋并切片，操作步骤如下：石蜡切片
Vhl-R GCACACTAGCTTCCTCACCA 20
脱蜡至水，蛋白酶 K 修复后破膜，双氧水阻断内
Bax-F TGACCGTGGCAAAGAGCA 18
Bax 源性过氧化物酶，室温平衡，加混合反应液，
Bax-R GATCCAGGCGGAAATGTG 18
DAB 显色，苏木素复染细胞核，脱水中性树胶封
Caspase-3-F GGGAAACTGGGCTACAAA 18
Caspase-3 片。细胞核经苏木素着色变蓝，DAB 显出来的阳
Caspase-3-R CTCAGCAACACGCAAACA 18
性凋亡细胞核为棕黄色。
Bcl-2-F CGTAGCCTCGCTTCAAAA 18
Bcl-2
Bcl-2-R CGCGTCAGATCAATTCACA 19 1.8 数据分析
p53-F CGTCGTAGCAGTGTCTAAAGT 21 使用 软件进行数据统计分析，对
p53 SPSS 22.0
p53-R GACCCTCTTGTCCATTGTG 19
照组和低氧组表达模式的数据采用双尾 t-test 检验
NPY-F CACGACGCACAGCATCAC 18
NPY 统计差异，当 P<0.05 时认为差异显著 (标为*)，
NPY-R AGCACAAACACGCCACAA 18
P<0.01 认为差异极显著 (标为**)，P 值均采用实
PYY-F CTTTACCCTGTTCCTGTGC 19
PYY 验组与对照组相比得出，结果用平均值±标准差
PYY-R TCCCTGGTTGTGGTCATT 18
(mean±SD) 表示。
CCK-F ACACGATGCCAACACCCG 18
CCK
CCK-R TCCAGCCCAAGTAGTCCC 18 2 结果
NUCB2-F AATCAATCATCCTGGCAGTC 20
NUCB2
NUCB2-R CGTTCGTTGGGTCGTAGA 18 2.1 低氧胁迫和恢复对长吻鮠脑组织氧传感蛋
β-actin-F TGCTGCCTCTTCCTCCTCTC 20 白的影响
β-actin
β-actin-R GGACACCTGAACCTCTCATTGC 22
在低氧胁迫下，HIF-1α 和 PHD2 基因表达量
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