Page 51 - 《渔业研究》2025年第5期
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592 渔 业 研 究 第 47 卷
15 种，包括东方两极虫（Myxidium orientale） 、光 后经过系列乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、
唇两极虫（M. acrossocheilus） 、抚仙两极虫（M. 切片和苏木精−伊红染色等步骤。最后，利用光学
fusienense） 、四须鲃两极虫（M. barbodesi） 、长 显微镜对切片进行观察与拍照。
卵 形 两 极 虫 （ M. longiovaforme） 、 印 江 两 极 虫 1.4 基因组脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，
（M. acanthobramae） ，马边四极虫（Chloromyxum DNA）提取、扩增和测序
mapienensis） ，尖形粘体虫（Myxosoma acuta） 、马 利用通用型基因组提取试剂盒（CWBio，中
边粘体虫（M. mapienensis） 、光唇粘体虫（M. acros- 国）提取用无水乙醇保存的孢子的基因组 DNA。
socheilusi） ，以及倒卵形碘泡虫（M. obovoides） 、岷 使用基于 SSU rDNA 设计的 MyxospecF（TTCTGC-
江碘泡虫（M. minkiangensis） 、雷波碘泡虫（M. lei- CCTATCAACTWGTTG） 、 MyxospecR（ GGTTT-
poensis） 、似微孢碘泡虫（M. pseudomicrosporus） 、 CNCDGRGGGMCCAAC）引物对 [13] ，配合优化后的
光唇碘泡虫（M. acrossocheilusi） [6, 9] 。 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）
光唇鱼（A. fasciatus）隶属于鲤形目（Cyprini- 体系和条件，扩增粘孢子虫序列。PCR 反应体系
formes） 、鲤科（Cyprinidae） 、鲃亚科（Barbinae） 、 （25.0 μL）组成：2×AceTaq Master Mix（Vazyme，
光唇鱼属（Acrossocheilus） ，是中国特有的一种杂 中国）12.5 μL、正反向引物各 0.5 μL（10 μmol/L） 、
食性鱼类 [10] ，主要分布于浙江、江苏、安徽和福 基因组 DNA 模版 1.0 μL 和双蒸水 10.5 μL。PCR
建等省份的河溪中 [11] 。近年来，山东多地引进光 反应条件：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性 50 s，
唇鱼并开展人工养殖。目前，尚未有光唇鱼感染粘 55 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸 2 min，进行 35 次循
孢子虫的报道。本研究对微山湖某养殖场的光唇鱼 环；72 ℃ 终延伸 7 min。取 PCR 扩增产物用 1% 琼
进行了粘孢子虫调查，在其鳃上分离到一种碘泡 脂糖凝胶进行分离，利用 ABIPRISM 3730XL DNA
®
虫，并利用形态学、组织学和分子生物学相结合的 测序仪（Applied Biosystems Inc.，Foster，美国）
方法对其进行了鉴定和描述，以期为光唇鱼寄生粘 进行 PCR 产物的双向测序。利用 BioEdit [14] 对测
孢子虫的研究提供资料。 序结果拼接和校正，将得到的最终序列提交至
GenBank。
1 材料与方法
1.5 分子系统发育分析
1.1 样品采集 将本研究获得的 SSU rDNA 序列在 GenBank
本研究从山东省济宁市微山县微山湖某养殖池 中进行 BLAST 比对，从中选取与济宁碘泡虫序列
塘（34°36′26″ N、117°22'24" E）采集 80 尾光唇鱼 相似性较高的 40 条碘泡虫序列进行系统发育分
（体长为 3.9~5.7 cm） ，使用 MS222 对光唇鱼进 析。同时，选择干地亚楚克拉虫（Zschokkella candia）
行麻醉，对鱼体表和各组织器官进行肉眼和显微检 和楔形两极虫（M. cuneiforme）作为外群。将选取
查。在光唇鱼鳃上发现粘孢子虫孢囊后，将新鲜孢 的序列通过 MAFFT v.7.490 [15] 进行多序列比对，
囊和孢子用于形态观察，被感染的鳃组织用 10% 利用 MEGA v.7 [16] 比对后的序列进行编辑和校
多聚甲醛固定，收集的孢子用无水乙醇固定。 对，随后分别利用最大似然法（Maximum like-hood，
1.2 形态学观察 ML）和贝叶斯法（Bayesian inferences，BI）进行
将带有孢囊的鳃组织放于载玻片上，滴加 1 滴 系统发育分析。将序列在 Akaike 信息标准下通过
生理盐水，用盖玻片将孢囊压裂，释放其中的孢 jModeltest [17] 筛选得到最佳核苷酸替代模型为 GTR+
子。依据 Lom 等 [12] 制定的标准进行孢子形态学观 I+G，并用于 ML 和 BI 分析。ML 分析通过 IQ-TREE
察，利用 ZEISS A1 光学显微镜（ZEISS，德国） v2.0 [18] 设置 10 000 个 Ultrafast Bootstrap Replicates
对孢子进行观察并拍照，随机选取 60 个成熟孢子 完成。BI 分析通过 MrBayes v3.2.7 [19] 软件设置替
记录其形态特征并测量形态学数据。测量值表示为 换模型参数 Nst 为 6、马尔可夫链蒙特卡罗方法
平均值±标准差（变化范围）的形式，均以 μm 为 （Markov chain Monte process）为 4 条链同时运行
单位。 2×10 代（每 100 代采集 1 次）完成。通过 MEGA
6
1.3 组织学分析 v7.0 [16] 或 Figtree v.1.4.3（http://tree.bio.ed.ac.uk/soft-
利用 10% 多聚甲醛固定被感染的鳃组织 48 h， ware/Figtree/）查看获得的系统发育树，并对系统
然后采用常规组织学方法进行石蜡切片的制作，先 发育树进行编辑和注释。
