Page 208 - 《水产学报》2026年第01期

1 期 水 产 学 报 50 卷

浙 江 、 湖 南 、 贵 州 等 地 的 鲤 、 镜 鲤 (C. carpio 1.4 基因组 DNA 提取、SSU rDNA 序列扩增与
haematopterus)、鲫 (C. auratus) 的鳃上被分离到 。 测序
[3]
近年来，黄明军 [10] 于湖北和重庆两地再次采集到
取无水乙醇保存的孢囊，利用通用型基因组
葡萄碘泡虫，对其进行了详细的形态学和组织学 提取试剂盒 (CWBio，中国) 提取基因组 DNA。利
描述，并首次提供了该碘泡虫的 SSU rDNA 序列。 用引物对 ERIB1/ERIB10 [13] 扩增粘体动物的 SSU
最近，谭禄奇等 [11] 在重庆和贵州地区采集了 4 个
rDNA 序列。PCR 扩增体系为 25 μL，包括每条引
葡萄碘泡虫株系，并对其孢子形态特征和 SSU 物各 0.5 μL (10 μmol/L)，基因组 DNA 模版 1 μL，
rDNA 序列进行了比较和分析。在上述研究中， 2 × AceTaq Master Mix (Vazyme， 中 国 )12.5 μL、
学者们发现葡萄碘泡虫在宿主鳃上仅形成少量的 双蒸水 10.5 μL。扩增条件：95 ℃ 预变性 5 min，
孢囊，未对宿主造成严重危害。 95 ℃ 变性 1 min，55 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸
近来，本研究团队发现葡萄碘泡虫大量寄生 2 min，进行 35 次循环，最后 72 ℃ 终延伸 7 min。
于锦鲤 (C. carpio var. koi) 鳃，并对宿主造成了严 利用 1% 琼脂糖凝胶分离 PCR 扩增产物。利用
®
重的组织损伤。为了全面了解寄生锦鲤的葡萄碘 ABIPRISM 3730XL DNA 测序仪 (Applied Biosys-
泡虫，对其孢子形态特征、组织病理以及分子系 tems Inc.，美国) 完成 PCR 产物的双向测序。利
统发育进行了系统研究。 用 BioEdit [14] 对测序结果进行拼接，并根据测序峰
图对拼接结果进行人工校正。最后，将拼接完成
1 材料与方法 的序列提交至 GenBank。
1.5 分子系统发育分析
1.1 样品采集
将本研究获得的葡萄碘泡虫 SSU rDNA 序列
2023 年 5 月从湖北省黄石市某观赏鱼养殖场
在 NCBI 网站进行 BLAST 比对，从中选取 51 条
(30° N，115° E) 采集 20 尾锦鲤 (体长 19.5~28.9 cm)。
与葡萄碘泡虫序列相似性较高的粘体动物序列，
使用 MS222 麻醉后，肉眼和显微观察锦鲤各器官
同时选择楔形两极虫 (Myxidium cuneiforme) 和干
组织中是否存在粘体动物孢子或者孢囊。在锦鲤
地亚楚克拉虫 (Zschokkella candia) 为外群。使用
鳃部发现粘体动物孢囊后，将鳃部组织和孢囊分 [15]
MAFFT v.7.490 对选取的序列进行多重比对，并
别用 10% 多聚甲醛和无水乙醇固定，用于形态学、
经过人工编辑、校对。然后，分别利用最大似然
组织学和分子生物学研究。
法 (ML) 和贝叶斯法 (BI) 对序列进行系统发育分
1.2 形态学观察 析。在 Akaike 信息标准下，利用 jModeltest [16] 筛
选所选择序列的最佳核苷酸替代模型。结果显示，
将 10% 多聚甲醛固定的孢囊放置在载玻片上，
最佳模型为 GTR + I + G，并将其应用于 ML 和 BI。
利用解剖针刺破孢囊释放其中的孢子。利用光学
利用 IQ-TREE v2.0 [17] 设置 10 000 个 Ultrafast Boot-
显微镜 (A1，Zeiss，德国) 观察孢子的形态特征并
strap Replicates 进行最大似然分析。利用 MrBayes
测序其形态学数据 。测量数字均以微米(μm) 为
[12]
v3.2.7 [18] 软件进行贝叶斯推理分析，替换模型参
单位，以平均值±标准差 (变化范围) 的形式表示。
数 Nst 设置为 6，通过马尔可夫链蒙特卡罗方法
本研究获得了中国山东省实验动物管理和使用伦
(Markov Chain Monte process) 设置为 4 条链同时运
理委员会批准 (批号：SD2007695)，实验过程中操
6
行 2 × 10 代，每 100 代采 1 次。获得的系统发育
作人员严格遵守山东省实验动物管理和使用伦理
树 由 MEGA v.7 [19] 或 Figtree v.1.4.3 (http://tree.bio.
委员会伦理规范，并按照山东省实验动物管理和
ed.ac.uk/software/Figtree/) 进行查看、编辑和注释。
使用伦理委员会制定的规章制度执行。
1.3 组织病理学分析 2 结果
利用 10% 多聚甲醛将鳃组织固定 48 h 后，按
2.1 孢囊和孢子的形态学特征描述
照常规组织学方法制作石蜡切片，包括系列乙醇
脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片 (厚度为 对采集的 20 尾锦鲤进行检查，发现 4 尾锦鲤
45 μm)、苏木精-伊红 (H.E) 染色等 [10] 。随后，利 的鳃上存在大量白色孢囊，孢囊存在于每个鳃片
用光学显微镜对鳃组织切片进行观察和拍照。 上 (图 1)，其他组织和器官中未发现孢子或孢囊。

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